1、實驗應在超凈工作臺或者生物安全柜內進行;
2、實驗的過程中選擇尺寸的手套并能及時更換,在進出不同實驗區域或進行模板操作后都應更換實驗服、口罩、帽子及手套,以避免不同實驗區交叉污染;
3、裝有PCR試劑的反應管在打開之前應先瞬時離心,將管壁及管蓋上的液體離至管底,降低污染手套或加樣器的風險;謹慎開啟反應管,防止管內液體濺出或形成氣溶膠導致污染;需要高溫加熱的樣本,可采用封口膜進行PCR管蓋密封,避免管蓋應受熱而發生彈開;
4、吸加試劑和模板的操作應嚴格按照規范要求進行,遵守“慢吸快打”原則,盡量一次性完成,忌多次抽吸,以避免氣溶膠產生的交叉污染;
5、PCR試劑建議小量分裝,以減少反復凍融、重復取樣次數和反復使用過程中的試劑污染;多樣本PCR反應時,先配制反應混合液分裝至反應管中,加入樣本核酸,請勿同時開蓋,盡量保證單人單管,實現完全閉管操作;

6、實驗試劑應與樣品和PCR產物分開保存,不應放于同處;
7、PCR擴增實驗完成后及時將反應管取出,用一次性手套或者塑封袋將產物反應管包裹丟棄,保證管蓋緊閉;
8、實驗室自配試劑(去離子水、緩沖液等)和所有使用器具在使用之前均應高壓滅菌或紫外殺菌,尖、反應管等實驗耗材應一次性使用。







樣本間交叉污染
主要是在采(取)樣的過程中,由于取樣工具之間的交叉造成污染;或者在核酸提取的過程中,由于移液器、離心管等使用不當導致的污染。
PCR試劑的污染
主要是在PCR試劑配制過程中,由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。
質粒的污染
在實驗室操作中經常會用到陽性參考品,這些陽性參考品大多數是由某些質粒制作而成,質粒在單位容積內濃度高,不小心使用極易造成污染。
PCR擴增產物污染
這是PCR反應中常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大,遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限,所以極微量的PCR產物污染,就可造成假陽性結果。還有一種容易忽視,可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染,在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,據計算一個氣溶膠顆粒可含4.8萬拷貝,因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。
輔料的質檢應結合實際工作中可能用到的場景,并非越苛刻越好,需要每個實驗室結合自身情況來設計和調整文中提到的參數。
1.離心管
(1)滲漏密閉性:將n個離心管加入半量墨汁,蓋好蓋子后放入水中,浸泡30min,沒有墨汁滲出為合格。
(2)離心密閉性:將n個離心管加入半量純水,放入離心機,10000 rpm,30min,管蓋未崩開未漏液為合格。
(3)熱密閉性:將n個離心管加入半量純水,蓋好蓋子稱重后放入金屬浴中,65℃或90℃(巴氏消毒),30min,再進行稱重,離心管未變形,管蓋未崩開未漏液,前后重量未變化為合格。
(4)冷密閉性:將n個離心管加入半量純水,放入-20℃冰箱,24h,離心管未變形,管蓋未崩開未漏液為合格。

(5)污染物質檢:將n個離心管分別加入半量陰性純水,蓋好蓋子渦旋1 min后靜置5min,吸取純水作為模板進行擴增,qPCR無擴增為合格。
(6)抑制物質檢:將n個離心管分別加入弱陽性質控物,室溫靜置5min,然后進行提取;RNA核酸,DNA核酸,室溫靜置5min,作為模板進行擴增,qPCR擴增未被抑制為合格。